關鍵詞:Northern Blot技術服務|實驗技術服務
簡介：世界*品牌Northern Blot技術服務|實驗技術服務原裝，質量保證,*。
Northern Blot技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。在獲得重組蛋白產品的同時，我們也會提供相應的原始數據和原始圖片,不需要再額外花費精力重復實驗。另一方面，我們所有的實驗數據真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌：   http://www.。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程：
一、 試劑準備
1.  0.5M EDTA：EDTA 16.61g加ddH2 O至80ml，調pH至8.0，定容至100ml。
2． 50mM NaAc：NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml，加DEPC 0.5ml，振蕩，37℃高壓滅菌。
3． 5×甲醛凝膠電泳緩沖液：MOPS [3-(N-瑪琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml，用2N NaOH調pH至7.0，再加入0.5M EDTA 10ml，加DEPC H2O至500ml。無菌抽濾，室溫避光保存。
4． 20×SSC：NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH調pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。
5. 6×SSC：20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC處理,高壓滅菌。
6．50×Denhardt：聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml，無菌抽濾、分裝。
7．1M Na2HPO4：Na2HPO4-12H2O 35.81g，加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4： NaH2PO4-2H2O 15.6g， 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)：Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE緩沖液：1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml，0.5M EDTA，0.5ml，5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
11.預雜交液：20×SSC 5ml，甲酰胺10ml，50×Denhardt 4ml，1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6），10%SDS 1ml，總體積 20ml。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml），使終濃度為4μl/ml。
12. DEPC H2O：1000mldd H2O中加入DEPC 1ml，充分振蕩，37℃高壓滅菌。
二、操作步驟
1. 總RNA提取。
2.  變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加熱熔化，于保溫狀態(tài)下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混勻、制膠。待膠凝固后，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預電泳5min。
3. 樣品制備：取總RNA4.5μl(約20-30μg) ，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃溫育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上樣緩沖液2μl。
4. 電泳：上樣，50V電泳（電泳時間約2hr左右）。電泳結束后將膠塊置紫外燈下，觀察RNA的完整性，記錄18S、28S條帶的位置（離加樣孔的距離）。
5.  將RNA從變性膠轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：
① 按膠塊大小剪取膜一張，用DEPC水中浸濕后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。將膠塊切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。
② 用長和寬均大于凝膠的一塊有機玻璃板作為平臺，將其放入大的干烤皿上，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20×SSC使液面略低于平臺表面，當平臺上方的3MM濾紙濕透后，用玻棒趕出所有氣泡。
③ 將凝膠翻轉后置于平臺上濕潤的3MM濾紙中央，3MM濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。
④ 用Parafilm膜圍繞凝膠四周，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾。
⑤ 在凝膠上方放置預先已浸濕的尼龍膜，排除膜與凝膠之間的氣泡。
⑥ 將二張已濕潤的、與凝膠大小相同的3MM濾紙置于膜的上方，排除濾紙與濾膜之間的氣泡。
⑦將一疊（5-8cm厚）略小于3MM濾紙的紙巾置于3MM濾紙的上方，并在紙巾上方放一塊玻璃，然后用一個重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經凝膠向膜上行流路，以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA轉移持續(xù)進行15hr左右。在轉膜過程中，當紙巾浸濕后，應更換新的紙巾。
7.轉移結束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙。將膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上殘留的凝膠。
8.將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的RNA。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存?zhèn)溆谩?br>10. 探針標記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
① 取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中，95-100℃變性5min，冰浴5min。
② dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混勻。
③ 將下列反應成份混合，加入上述微量離心管中：
dNTPmix           2.0μl
BSA(10mg/ml )     2.0μl
5×buffer        10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP        5.0μl
加入適量dd H2O使反應總體積達50μl，輕輕混勻。室溫下反應1hr。
11. 預雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶，加入預雜交液5ml，42℃預雜交3hr。
12. 雜交：將變性的探針（95-100℃變性5min，冰浴5min）加入到預雜交液中，42℃雜交16hr。
13. 洗膜：
① 傾去雜交液。
② 2×SSC/0.1%SDS室溫洗15min。
③ 0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。
14.壓片：將膜用dd H2O漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-70℃放射自顯影3～7天左右。
注意事項：
操作應該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。Northern blot 的優(yōu)勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現、可允許探針的部分不配對性，雜交過后的膜經過一定的處理除去探針后還可保存很長時間再次雜交使用。