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英國ProImmune 公司是免疫學功能檢測多聚體產品和服務*的*。產品包括重組的MHC Class I 五聚體和MHCClass II 六聚體，用于特異性的T 細胞免疫功能檢測。廣泛用于腫瘤，傳染性疾病，自身免疫學疾病和移植等熱門領域的基礎，新藥和臨床研究。
五聚體(ProImmune)結合胞內細胞因子染色在國外正在成為很多實驗室的常規實驗。五聚體可用于檢測和分離少至淋巴細胞0.02%的抗原特異性CD8+T細胞群。然而，并不是所有的抗原特異性T細胞都具有功能，功能性細胞的比例因個體和疾病不同而異。可以通過對另外的胞內細胞因子聯合染色來研究抗原特異性T細胞的免疫效應功能。
細胞因子的產生對免疫反應起著重要的作用。細胞因子作用的范例包括干擾素-γ（IFNγ）誘導產生的許多抗病毒蛋白、IL-2誘導產生的T細胞增殖、以及腫瘤壞死因子α（TNFα）對病毒基因表達和復制的抑制。細胞因子不是預先形成的，而是在受到相關刺激時才迅速產生和分泌的。因此，胞內細胞因子的染色依賴于在蛋白轉運抑制劑存在的情況下（以將細胞因子截留在細胞內）對細胞的刺激。
激起細胞因子產生的細胞活化一般會導致T細胞受體的下調。因此，如果需要同時檢測T細胞特異性，則應在細胞活化前進行Pro5R五聚體染色以確保染色水平。在此期間五聚體可能會與T細胞受體一同被內化，但仍可以在透化細胞內檢測到。研究抗原特異性T細胞的效應功能時，先將細胞以五聚體染色，然后再用抗原刺激，隨后用針對細胞外表位（如CD8）的特異性抗體進行染色，zui后再進行膜透化和胞內細胞因子染色。
Pro5R五聚體結合胞內細胞因子染色檢測IFNγ、TNFα、MIP-1β或IL-2
操作步驟：步驟10前的所有操作在無菌環境下進行，使用無菌緩存液和無菌條件。
1.離心Pro5R五聚體，冷凍微型離心機（14000×g，5min）。
2.制備外周血細胞，PBS中細胞濃度2×107cells/ml。
3.分別將細胞懸液50μl加入到多個試管中。
4.添加熒光標記的五聚體到需要的試管中，22℃孵育10min（無刺激的信號對照在該步驟時不要染色）。在剩下的試管中加入10μl的PBS。
5.在每個管中加入500μlPBS，離心450×g，5min，10℃。
6.去掉上清液，震動分散細胞，用200μl的R10培養液重懸。
7.用R10培養液1:50稀釋肽蛋白原液。取2μl（終濃度10μg/ml）加入到需要的管中。
如果使用LAC作為對照，在37℃水浴中快速復溶，取0.33μl至每個需要的管。使用后，丟棄剩下的LAC。
8.將試管置于37℃，加濕CO2培養箱中孵育15min-1h。
9.加入Brefeldin A（終濃度10μg/ml）到需要的管中（注意：LAC中含有Brefeldin A），重新放回培養箱中孵育15h。孵育中產生特定細胞因子的*刺激階段是不同的，是需要確定的。上述實驗中16h的孵育時間是對人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激誘導產生IFNγ的*孵育時間。根據刺激方法和選擇的細胞因子效應，孵育時間各不相同。
10.從培養箱中取出試管，離心450×g，5min，10℃。
11.去除上清，在需要的管中用50μl含*濃度的anti-CD8抗體的PBS重懸細胞，其它管中加50μlPBS。
信號-顏色對照在此步驟時染色。另外，如果需要樣本額外的亞型，針對其它細胞表面標志或受體的抗體也在這時加入。
12.冰上孵育20min。
13.每管加入500μlPBS洗滌，離心450×g，5min，10℃。
14.去除上清，震動分散細胞。
15.每個樣本管加入200μl 4% Paraformaldehyde，渦旋混勻。冰上孵育20min。
此步中要固定活細胞形態。
此步時操作可以暫停，重復進行13和14步，重懸細胞，100μlPBS/管，遮蓋管口，細胞放4℃可儲存3天。再次進行操作時，重復步驟13和14，重懸細胞每管200μl Permeabilization，然后進行步驟17。
16.每管加入200μl Permeabilization。
17.離心450×g，5min，10℃，棄上清。
18.樣品管加入100μl Permeabilization，用抗細胞因子抗體染色。在剩余管（如信號-顏色對照）中加入100μl的PBS。
19.室溫孵育5min。
20.加入*濃度的FITC-抗細胞因子抗體到需要的樣品管中，混勻。
21.室溫孵育20min。
22.每管加入200μl Permeabilization，離心450×g，5min，10℃，棄上清，震動分散細胞。
23.200μl Fix buffer重懸細胞，渦旋混勻。
加入固定液時渦旋是很重要的，以使細胞不會成團。
注意：
1.孵育階段：特定的細胞因子誘導刺激的*時間是不同的需要確定的。上述實驗中16h的孵育時間是對人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激誘導產生IFNγ的*孵育時間。根據刺激方法和選擇的細胞因子效應，孵育時間各不相同。
2.肽蛋白濃度：調查細胞因子反應效應的滴度。
3.五聚體染色：細胞活化產生細胞因子可能會使T細胞受體下調，這會影響隨后的五聚體染色，所以，推薦五聚體在細胞活化之前染色。
4.抗體濃度：調查anti-CD8和anti-cytokine抗體的有效滴度。anti-CD8抗體滴度會阻止其它抗體介導的封閉或與五聚體競爭結合的位點。
5.蛋白質轉運抑制：Brefeldin A抑制細胞內蛋白的轉運。細胞培養環境中BrefeldinA菌的存在會阻止蛋白質在高爾基復合體的轉運，使蛋白質積聚在內質網內。Brefeldin A菌會增強大多數胞內細胞因子的檢測，所以，建議在特定的實驗中需要檢查實驗試劑的有效性，是否含有蛋白質轉運制抑制劑（如Monensin）。
6.背景染色：當進行五聚體染色時，如果背景染色過高，需先用Fc封閉或10%小鼠血清來封閉細胞。其它減少非特異染色的方法可參見ProImmune相關技術文獻。
7.如果需要沒有五聚體結合的胞內細胞因子染色則去掉實驗步驟1-4
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